Microscopia de fluorescência

A microscopia de fluorescência usa uma lâmpada de mercúrio ou xenônio para produzir luz ultravioleta. A luz vem do microscópio e incide sobre um espelho dicróico - espelho que reflete comprimentos de onda de um determinado intervalo e permite que comprimentos de onda de outro intervalo passem através dele. O espelho dicróico reflete a luz ultravioleta até o espécime. Essa luz excita a fluorescência dentro das moléculas no espécime. A ultravioleta excita a fluorescência dentro das moléculas no espécime. A objetiva coleta a luz de comprimento de onda fluorescente que foi produzida. Esta luz fluorescente passa através do espelho dicróico e de um filtro de barreira (capaz de eliminar outros comprimentos de onda além do fluorescente), levando-a para formar a imagem na ocular.

 

 

Trajeto da luz em um microscópio de epifluorescente

Epifluorescência A epifluorescência é um conjunto de óptica para um microscópio fluorescente no qual a objetiva é usada tanto para focalizar a luz ultravioleta sobre o espécime, como para captar a luz fluorescente do espécime. Ela é mais eficiente do que a fluorescência transmitida, na qual uma lente ou condensador é empregado para focalizar a luz ultravioleta no espécime. A epifluorescência também possibilita que a microscopia fluorescente seja combinada com outro tipo no mesmo microscópio.

As moléculas fluorescentes dentro do espécime podem ocorrer naturalmente ou ser introduzidas. Por exemplo, é possível colorir células com um corante chamado calceína-AM. Essa tinta, por si mesma, não é fluorescente. A porção AM (acetoximetil) da molécula oculta uma porção da molécula de calceína que liga o cálcio, este sim, fluorescente. Quando se faz a mistura da calceína/AM com a solução que banha as células, o corante se hibridiza na célula. As células vivas têm uma enzima que remove a porção AM e prende a calceína dentro da célula fazendo com que ela ligue o cálcio tornando-o verde fluorescente sob a luz ultravioleta (células mortas deixam de ter essa enzima). Em seguida, as células vivas ficam verde-fluorescentes, ao passo que as células mortas não ficam fluorescentes. Podem-se ver as células mortas no mesmo espécime misturando-se outro corante chamado iodeto de propídio, que penetra apenas nas células mortas. O iodeto de propídio se liga ao DNA no núcleo e fica com a cor fluorescente vermelha sob a luz ultravioleta. Essa técnica de duplo corante é usada em estudos toxicológicos para determinar a porcentagem da população de células que perece quando tratada por um produto químico de proteção ambiental (como um pesticida, por exemplo).

Foto cedida por Theresa M. Freudenrich Imagem fluorescente de células cultivadas do cérebro de um rato. Células vivas com calceína (esquerda) e células mortas coloridas com iodeto de propídio (direita).

As técnicas de microscopia de fluorescência são úteis para exibir estruturas e mensurar eventos fisiológicos e bioquímicos nas células vivas. Existem vários indicadores fluorescentes para o estudo de muitos produtos químicos fisiologicamente importantes como DNA, cálcio, magnésio, sódio, pH e enzimas. Além disso, os anticorpos específicos de várias moléculas biológicas podem estar quimicamente ligados às moléculas fluorescentes e ser usados para manchar estruturas específicas dentro das células. 

A seguir examinaremos as funções e os componentes de um microscópio de luz.