Tipos de microscópios

Autor: 
Craig C. Freudenrich, Ph.D.
Preparação do espécime
A luz que forma a imagem passa através do espécime e, dessa maneira, ele é observado. Quanto mais espesso ele for, menos luz o atravessa. Quanto menos luz passar através dele, mais escura ficará a imagem. Por essa razão os espécimes devem ser finos (0,1 a 0,5 mm). Muitos espécimes vivos devem ser cortados em secções finas antes de serem observados. Espécimes de rocha ou semicondutores são muito espessos para serem seccionados e observados pela transmissão da luz, de modo que são observados pela luz refletida de suas superfícies.

Um dos principais problemas na observação de espécimes (ou amostras) sob o microscópio é que as imagens não possuem muito contraste. Isso acontece principalmente em relação aos espécimes vivos (como é o caso das células), embora pigmentos naturais como o verde das folhas possam dar bom contraste. Uma forma de melhorar o contraste é tratar o espécime com pigmentos coloridos, ou corantes, que se ligam às estruturas específicas dentro dele. Tipos diferentes de microscopia foram desenvolvidos para melhorar o contraste nos espécimes. As especializações encontram-se principalmente nos sistemas de iluminação e nos tipos de luz que atravessam o espécime. Por exemplo, um microscópio de campo escuro usa um condensador especial para bloquear a maior parte da luz brilhante e para iluminar o espécime com luz oblíqua, de forma semelhante ao que a lua faz quando bloqueia a luz do sol durante um eclipse solar. Esse ajuste óptico fornece um plano de fundo totalmente escuro e aumenta o contraste da imagem para salientar pequenos detalhes - áreas brilhantes nos limites da amostra.

As diversas técnicas da microscopia de luz são: campo claro, campo escuro e iluminação de Rheinberg.

  • Campo claro - é a configuração básica do microscópio (as imagens vistas até agora são todas de microscópios de campo claro). É uma técnica que tem muito pouco contraste. Nas imagens mostradas até agora, grande parte do contraste foi obtida tingindo-se os espécimes.
  • Campo escuro - essa configuração aumenta o contraste, como mencionado anteriormente. 
  • Iluminação Rheinberg - trata-se de uma configuração semelhante ao do campo escuro, mas que usa uma série de filtros para produzir uma "coloração óptica" do espécime. 

As técnicas que serão mostradas abaixo usam os mesmos princípios básicos da iluminação Rheinberg e conseguem resultados distintos usando componentes ópticos diferentes. A idéia básica envolve a divisão do feixe de luz em dois caminhos que iluminam o espécime. As ondas de luz que passam através de estruturas densas no interior do espécime têm a velocidade diminuída, comparativamente com aquelas que passam por estruturas menos densas. Como todas as ondas de luz são coletadas e transmitidas para a ocular, elas se recombinam de modo que acabam por interferir umas com as outras. Os padrões de interferência fornecem contraste: podem mostrar áreas escuras (mais densas) contra um plano de fundo claro (menos denso) ou criar um tipo de falsa imagem tridimensional (3D).

  • Contraste de fase - é a melhor técnica para examinar espécimes vivos (como células cultivadas, por exemplo).


Trajeto da luz em um microscópio de contraste de fase
    Em um microscópio de contraste de fase, a luz é separada pelos anéis anulares na objetiva e pelo condensador. A luz que passa através da parte central do trajeto de luz é recombinada com a luz que se propaga em torno da periferia do espécime. A interferência produzida por esses dois trajetos produz imagens nas quais as estruturas densas aparecem mais escuras do que o fundo. 

Foto cedida por Theresa M. Freudenrich
Imagem com contraste de fase de uma célula cultivada do cérebro de um rato
  • Contraste de interferência diferencial (DIC) - o DIC usa filtros polarizadores e prismas para separar e recombinar trajetos de luz dando ao espécime uma aparência tridimensional. O DIC também é chamado de Nomarski, em homenagem ao homem que o inventou.
  • Contraste de modulação Hoffman - é semelhante ao DIC, exceto pelo fato de usar placas com pequenas fendas no eixo do trajeto da luz, assim como fora dele, produzindo dois conjuntos de ondas de luz que passam através do espécime. Como anteriormente, é formada uma imagem em 3D. 
  • Polarização - o microscópio de luz polarizada usa um polarizador de cada lado do espécime posicionados ortogonalmente, de tal forma que somente a luz que passe através do espécime alcance a ocular. A luz é polarizada em um plano à medida que passa através do primeiro filtro e alcança o espécime. Partes padronizadas ou cristalinas do espécime, com espaçamento regular, giram a luz passando através delas. Uma porção dessa luz que foi girada passa através do segundo filtro de polarização, de modo que essas áreas regularmente espaçadas mostram brilho contra um plano de fundo escuro. 
  • Fluorescência - este tipo de microscópio usa luz de comprimento de onda curto e de alta energia (normalmente ultravioleta) para excitação de elétrons dentro de algumas moléculas no interior do espécime, fazendo com que esses elétrons mudem para órbitas com mais energia. Quando voltam para seus níveis de energia iniciais, emitem luz com menos energia e comprimento de onda maior (geralmente no espectro visível) formando, dessa maneira, a imagem.

A seguir veremos a microscopia fluorescente de forma mais detalhada.